Enzimas de restricción y diseño de primers

Objetivo

Que el alumno conozca las herramientas bioinformáticas utilizadas en la elaboración de mapas de restricción y diseño de oligonucleótidos para PCR y RT-PCR.
 

Instrucciones

Sigue las siguientes instrucciones utilizando los programas necesarios. De preferencia utiliza los programas sugeridos. Si utilizas algún otro método especifícalo dentro del análisis.
 
 

= = = > > > > > >  TUTORIAL < < < < < < = = =

 
1.     Identifica la siguiente secuencia en la base de datos de nuclotide ID AY212253.1
AY212253.1 sequence
2.     Copia la secuencia en el programa Editseq  de la suite Lasergene.
 

Ejemplo Copiar AY212253.1

 

3.     A la secuencia genética 6329 que se han encontrado agrega 100 pb rió arriba y rió abajo del marco de lectura abierto y marcarlos dandoles un formato de letras mayúsculas para las regiones UTR 5′ y 3′ y con letra minúscula la región del ORF y guarda la secuencia con un nombre corto.

Gene ID 6329

Ejemplo: Agregar 100pb rio arriba y abajo del gen

 
 
 
 
 
 4.     Busca las características del vector PGEM-T en la base de datos de Addgene y guarda la secuencia utilizando ediseq (ver ejemplo paso 2)

Ejemplo buscar Vector y guardalo en Editseq

 
5.     Utiliza la secuencia AY212253.1 y del Vector pGEM-T para generar sus respectivos mapa de restricción utilizando NEBcutter  y guárdalos.
 
6.     Crea el mapa del vector en el programa SnapGene y compáralo con el generado en el paso previo. Deberás personalizar tu mapa del vector de manera creativa.

Ejemplo uso de SnapGene Viewer


 
7.     Genera dos oligonucleótidos (Sentido y anti sentido) para poder insertar el gene de AY212253.1 utilizando los programas Primer 3  y PrimerSelect de Lasergene y anota las diferencias.
 

Ejemplo Generación de primers en PrimerSelect

8.     Muta los oligonucleótidos para insertar el sitio de restricción para EcoRV GAT_ATC y analízalos en PrimerSelect y en OlogoAnalizer 3.1 y determina si tienen una buena calidad para llevar a cabo la inserción en el vector.

Ejemplo Mutacion en PrimerSelect

 
9.     Realiza la inserción de la secuencia del AY212253.1 en el vector de manera manual y genera nuevamente el mapa en SnapGene y NEBcutter y guarda tu resultado en forma de imagen mostrando la presencia del ORF del gen insertado.