Enzimas de restricción y diseño de primers
Objetivo
Que el alumno conozca las herramientas bioinformáticas utilizadas en la elaboración de mapas de restricción y diseño de oligonucleótidos para PCR y RT-PCR.
Instrucciones
Sigue las siguientes instrucciones utilizando los programas necesarios. De preferencia utiliza los programas sugeridos. Si utilizas algún otro método especifícalo dentro del análisis.
= = = > > > > > > TUTORIAL < < < < < < = = =
1. Identifica la siguiente secuencia en la base de datos de nuclotide ID AY212253.1
AY212253.1 sequence2. Copia la secuencia en el programa Editseq de la suite Lasergene.
Ejemplo Copiar AY212253.1
3. A la secuencia genética 6329 que se han encontrado agrega 100 pb rió arriba y rió abajo del marco de lectura abierto y marcarlos dandoles un formato de letras mayúsculas para las regiones UTR 5′ y 3′ y con letra minúscula la región del ORF y guarda la secuencia con un nombre corto.
Gene ID 6329Ejemplo: Agregar 100pb rio arriba y abajo del gen
4. Busca las características del vector PGEM-T en la base de datos de Addgene y guarda la secuencia utilizando ediseq (ver ejemplo paso 2)
Ejemplo buscar Vector y guardalo en Editseq
5. Utiliza la secuencia AY212253.1 y del Vector pGEM-T para generar sus respectivos mapa de restricción utilizando NEBcutter y guárdalos.
6. Crea el mapa del vector en el programa SnapGene y compáralo con el generado en el paso previo. Deberás personalizar tu mapa del vector de manera creativa.
Ejemplo uso de SnapGene Viewer
7. Genera dos oligonucleótidos (Sentido y anti sentido) para poder insertar el gene de AY212253.1 utilizando los programas Primer 3 y PrimerSelect de Lasergene y anota las diferencias.
Ejemplo Generación de primers en PrimerSelect
8. Muta los oligonucleótidos para insertar el sitio de restricción para EcoRV GAT_ATC y analízalos en PrimerSelect y en OlogoAnalizer 3.1 y determina si tienen una buena calidad para llevar a cabo la inserción en el vector.
Ejemplo Mutacion en PrimerSelect
9. Realiza la inserción de la secuencia del AY212253.1 en el vector de manera manual y genera nuevamente el mapa en SnapGene y NEBcutter y guarda tu resultado en forma de imagen mostrando la presencia del ORF del gen insertado.