Practica 3

Modelaje por homología de una proteína

 
Objetivo: Que el alumno genere un modelo in silico mediante la técnica por homología y que analice su calidad utilizando herramientas de visualización de estructuras especializadas.

Instrucciones: Sigue los siguientes pasos utilizando los programas necesarios. De preferencia utiliza los programas sugeridos.

= = = > > > > > > < < < < < < = = =

Podrás descargar todos los archivos de ejemplo de este proyecto en la siguiente carpeta comprimida
Proyecto 3.zip
 
1.     A pesar de que se pueden generar modelos de baja resolución con los sistemas GENO 3D y SWISSMODEL en esta ocasión utilizaremos un modelaje por homología local utilizando el programa modeller version 9 utilizando la consola de CHIMERA 1.12.
CHIMERA 1.12
web pageoficial USCF Chimera
 
Tutorial de instalación Chimera

Nota: debes asegurarte de tener el programa más actualizado dado que recientemente NCBI cambio el sistema de repositorios y estos no son reconocidos por CHIMERA 1.11.

2.    Debes tener instalado MODELLER v9.
MODELLER v9
web pageoficial

Nota: para instalar MODELLER debes de estar registrado, se pueden registrar con su email institucional BUAP en la página oficial (recomendado) o en esta ocasión puedes utilizar el código “MODELIRANJE”.

3.   Una vez instalados los programas empezaremos el proyecto. Primero tienes que identificar y guardar la secuencia UniProtKB – P41143 (OPRD_HUMAN); en formato fasta en un bloc de notas como “squence P41143.txt”.
Sequence P41143

4.    Realiza una búsqueda BLAST utilizando la sequence P41143 y la base de datos de RCSB pdb (PDB protein database). Guarda en un bloc de notas los 2 mejores alineamientos en un bloc de notas y nómbralo “BLAST_analisis.txt”


Example BLAST with PDB protein database

5.   Busca en la base de datos PDBsum información al respecto del PDB ID: 4N6H, contesta:

–  ¿Cuál es la relación con la sequence P41143?

–  ¿Cuál es su centro activo (ver pestaña protein)?

–  ¿Cuáles son sus ligandos (ver pestaña ligand)?

PDBsum – EMBL-EBI
6.   Descarga la secuencia en formato fasta de la estructura 4N6H (ver pestaña protein en PDBsum) guárdala en un bloc de notas y nómbrala “sequence 4N6H.txt” y utiliza el link hacia  RCSB – Protein Data Bank para descargar el archivo en formato PDB nómbralo “4N6H.pdb”.
Rcsb PDB 4n6h

Example PDBsum search and download PDB file



7.   Realiza un alineamiento múltiple de secuencias (MSA) entre la secuencias sequence P41143 vs sequence 4N6H y coloca el alineamiento en un block de notas nombrándolo “MSA_seqP41143vs4n6h File.txt”.
Clustal Omega

8.   Selecciona en la sequence P41143 las secuencias que no se pueden modelar seleccionándolos del análisis MSA colocándola en un bloc de notas nombrando el archivo “Seq4modelingP41143.txt”.

9.    Utiliza el programa Discovery Studio y abre el archivo 4N6H.pdb para eliminar los HETAMS y renombra la cadena como Z (ver video de ejemplo abajo) del archivo y genera guárdalo (File>Save as..) como Archivo Protein data Bank (*.pdb; *.pdb1; *.ent) con el nombre “4N6H_DS.pdb”.

Example discovery studio use

10.  Abre el archivo 4N6H_DS.pdb en el programa CHIMERA y después ve al menú Favorites>sequence.

• Dentro de la ventana que se abre ve al menú edit>add sequence y pega la secuencia que seleccionaste en el paso 8 y en la ventana nómbrala QueryX y dale OK.
• Después ve al menú structure>association y asocia la estructura 4N6H_DS a la secuencia QueryX y dale OK.
• Posteriormente ve hacia el menú  structure>Moleller (homology), en la consola de modeller selecciona el target 4N6H_DS chain Z y el template QueryX.
• Selecciona “Run Modeller locally” y antes de empezar selecciona la localización del archivo mod9.19.exe (búscalo en: C:Program FilesModeller9.19libx86_64-w64).
• Deja vacío el espacio de “Modeller script”. Presiona el botón “Advance Options” y cambia el número de outputs por 10 sin seleccionar incluir HETAMS y dale OK.

NOTA: En este paso tarda un poco si quieres cerciorarte que esta corriendo el programa puedes darle clic en el “task panel” que es el icono en forma de i (information) al lado de la lupa en la parte inferior derecha de la ventana principal.

Example Use of modeller (homology) in CHIMERA

11. Una vez obtenidos los modelos guardamos la sesión en el menú File>save sesión As… como “Model_P41143_RAWmodels.py” y guarda los primeros 4 modelos con el menú File>save as PDB con los nombres “Model_P41143_01.pdb”;” Model_P41143_02.pdb”;” Model_P41143_03.pdb”;”Model_P41143_04.pdb”.

12. Después utilizando los programas SwissPDB, Discovery Studio y/o CHIMERA para eliminar los aa de la secuencia que no se modelaron correctamente y guárda los modelos con el nombre “Model_P41143_01_-seq1-90.pdb”;” Model_P41143_02_-seq1-90.pdb”;” Model_P41143_03_-seq1-90.pdb”;”Model_P41143_04_-seq1-90.pdb”.

Example use of Swiss PDB viewer for delete aa


Example use of Discovery studio for delete aa

13.  Abre en una ventana diferente de CHIMERA y abre los 4 Archivos del paso anterior así como también el 4N6H_DS.pdb utiliza el menú tool>structure comparation>MatchMaker selecciona la estructura  4N6H_DS como “reference structure” y las otras como “structure to Match” y compara el RMSD de cada una de ellas Guarda el resultado en un archivo “RMSD.txt”. Guarda esta sesión como “Model_P41143_SessionMSA.py”.

Example use of Chimera for measure RMSD

14.  Abre la sesión Model_P41143_SessionMSA.py y después el archivo 4n6h.pdb (PDB original) en el cual se observa la interacción con el ligando. Utiliza el menú Actions>Atoms/bonds>show y se observaran todos los átomos utiliza la tecla shift y haz clic en un átomo cercano al ligando con el menú select>zone… selecciona un área cercana de 15 Angstroms (por default está en 5.0). Despues ve al menú Select>invert (All models) y después al menú actions>Atoms/bonds>hide y al menú actions>ribond>hide. Por ultimo ve al menú select>clear selection y al menú Action>focus. Guarda la sesión en este punto como “Model_P41143_Session_ComparativeSITE.py”


Example use of Chimera to show the active site



15.  Guarda todos tus resultados en una carpeta y nómbrala como se mencionó al principio comprímela dando clic derecho sobre la carpeta>enviar a>carpeta comprimida zip. Y subela a la plataforma en tiempo y forma.

Modelaje por homología de una proteína

 
Objetivo: Que el alumno genere un modelo in silico mediante la técnica por homología y que analice su calidad utilizando herramientas de visualización de estructuras especializadas.

Instrucciones: Sigue los siguientes pasos utilizando los programas necesarios. De preferencia utiliza los programas sugeridos.

= = = > > > > > > < < < < < < = = =

Podrás descargar todos los archivos de ejemplo de este proyecto en la siguiente carpeta comprimida
Proyecto 3.zip
 
1.     A pesar de que se pueden generar modelos de baja resolución con los sistemas GENO 3D y SWISSMODEL en esta ocasión utilizaremos un modelaje por homología local utilizando el programa modeller version 9 utilizando la consola de CHIMERA 1.12.
CHIMERA 1.12
web pageoficial USCF Chimera
 
Tutorial de instalación Chimera

Nota: debes asegurarte de tener el programa más actualizado dado que recientemente NCBI cambio el sistema de repositorios y estos no son reconocidos por CHIMERA 1.11.

2.    Debes tener instalado MODELLER v9.
MODELLER v9
web pageoficial

Nota: para instalar MODELLER debes de estar registrado, se pueden registrar con su email institucional BUAP en la página oficial (recomendado) o en esta ocasión puedes utilizar el código “MODELIRANJE”.

3.   Una vez instalados los programas empezaremos el proyecto. Primero tienes que identificar y guardar la secuencia UniProtKB – P41143 (OPRD_HUMAN); en formato fasta en un bloc de notas como “squence P41143.txt”.
Sequence P41143

4.    Realiza una búsqueda BLAST utilizando la sequence P41143 y la base de datos de RCSB pdb (PDB protein database). Guarda en un bloc de notas los 2 mejores alineamientos en un bloc de notas y nómbralo “BLAST_analisis.txt”


Example BLAST with PDB protein database

5.   Busca en la base de datos PDBsum información al respecto del PDB ID: 4N6H, contesta:

–  ¿Cuál es la relación con la sequence P41143?

–  ¿Cuál es su centro activo (ver pestaña protein)?

–  ¿Cuáles son sus ligandos (ver pestaña ligand)?

PDBsum – EMBL-EBI
6.   Descarga la secuencia en formato fasta de la estructura 4N6H (ver pestaña protein en PDBsum) guárdala en un bloc de notas y nómbrala “sequence 4N6H.txt” y utiliza el link hacia  RCSB – Protein Data Bank para descargar el archivo en formato PDB nómbralo “4N6H.pdb”.
Rcsb PDB 4n6h

Example PDBsum search and download PDB file



7.   Realiza un alineamiento múltiple de secuencias (MSA) entre la secuencias sequence P41143 vs sequence 4N6H y coloca el alineamiento en un block de notas nombrándolo “MSA_seqP41143vs4n6h File.txt”.
Clustal Omega

8.   Selecciona en la sequence P41143 las secuencias que no se pueden modelar seleccionándolos del análisis MSA colocándola en un bloc de notas nombrando el archivo “Seq4modelingP41143.txt”.

9.    Utiliza el programa Discovery Studio y abre el archivo 4N6H.pdb para eliminar los HETAMS y renombra la cadena como Z (ver video de ejemplo abajo) del archivo y genera guárdalo (File>Save as..) como Archivo Protein data Bank (*.pdb; *.pdb1; *.ent) con el nombre “4N6H_DS.pdb”.

Example discovery studio use

10.  Abre el archivo 4N6H_DS.pdb en el programa CHIMERA y después ve al menú Favorites>sequence.

• Dentro de la ventana que se abre ve al menú edit>add sequence y pega la secuencia que seleccionaste en el paso 8 y en la ventana nómbrala QueryX y dale OK.
• Después ve al menú structure>association y asocia la estructura 4N6H_DS a la secuencia QueryX y dale OK.
• Posteriormente ve hacia el menú  structure>Moleller (homology), en la consola de modeller selecciona el target 4N6H_DS chain Z y el template QueryX.
• Selecciona “Run Modeller locally” y antes de empezar selecciona la localización del archivo mod9.19.exe (búscalo en: C:Program FilesModeller9.19libx86_64-w64).
• Deja vacío el espacio de “Modeller script”. Presiona el botón “Advance Options” y cambia el número de outputs por 10 sin seleccionar incluir HETAMS y dale OK.

NOTA: En este paso tarda un poco si quieres cerciorarte que esta corriendo el programa puedes darle clic en el “task panel” que es el icono en forma de i (information) al lado de la lupa en la parte inferior derecha de la ventana principal.

Example Use of modeller (homology) in CHIMERA

11. Una vez obtenidos los modelos guardamos la sesión en el menú File>save sesión As… como “Model_P41143_RAWmodels.py” y guarda los primeros 4 modelos con el menú File>save as PDB con los nombres “Model_P41143_01.pdb”;” Model_P41143_02.pdb”;” Model_P41143_03.pdb”;”Model_P41143_04.pdb”.

12. Después utilizando los programas SwissPDB, Discovery Studio y/o CHIMERA para eliminar los aa de la secuencia que no se modelaron correctamente y guárda los modelos con el nombre “Model_P41143_01_-seq1-90.pdb”;” Model_P41143_02_-seq1-90.pdb”;” Model_P41143_03_-seq1-90.pdb”;”Model_P41143_04_-seq1-90.pdb”.

Example use of Swiss PDB viewer for delete aa


Example use of Discovery studio for delete aa

13.  Abre en una ventana diferente de CHIMERA y abre los 4 Archivos del paso anterior así como también el 4N6H_DS.pdb utiliza el menú tool>structure comparation>MatchMaker selecciona la estructura  4N6H_DS como “reference structure” y las otras como “structure to Match” y compara el RMSD de cada una de ellas Guarda el resultado en un archivo “RMSD.txt”. Guarda esta sesión como “Model_P41143_SessionMSA.py”.

Example use of Chimera for measure RMSD

14.  Abre la sesión Model_P41143_SessionMSA.py y después el archivo 4n6h.pdb (PDB original) en el cual se observa la interacción con el ligando. Utiliza el menú Actions>Atoms/bonds>show y se observaran todos los átomos utiliza la tecla shift y haz clic en un átomo cercano al ligando con el menú select>zone… selecciona un área cercana de 15 Angstroms (por default está en 5.0). Despues ve al menú Select>invert (All models) y después al menú actions>Atoms/bonds>hide y al menú actions>ribond>hide. Por ultimo ve al menú select>clear selection y al menú Action>focus. Guarda la sesión en este punto como “Model_P41143_Session_ComparativeSITE.py”


Example use of Chimera to show the active site



15.  Guarda todos tus resultados en una carpeta y nómbrala como se mencionó al principio comprímela dando clic derecho sobre la carpeta>enviar a>carpeta comprimida zip. Y subela a la plataforma en tiempo y forma.